Приятель, мечтавший о театре, уговорил его «за компанию» пойти на прослушивание в частную художественную студию Н.Н. Ходотова на Литейном. К своему изумлению, Евгений увидел в списках принятых свою фамилию, а не друга. Будучи ещё учеником, в 1928 году он стал заниматься по вечерам в студии на актёрском отделении. Преподавателями были актеры Александринского и Мариинского театров. Уроки мастерства вел Николай Николаевич Ходотов, корифей Александринки, показывая, как надо читать то или иное произведение.
В 1929 году окончил среднюю школу и после закрытия студии продолжил актёрское образование в Ленинградском художественном политехникуме, завершив обучение в 1930 году. С этого времени началась театральная деятельность Самойлова.

С 1930 года – актёр Ленинградского Театра актёрского мастерства под руководством Л. Вивьена;
В 1934-1938 годах – актёр театра имени В.Э. Мейерхольда;
В 1940-1967 годах – актёр театра Революции (ныне – Московский театр имени Вл. Маяковского);
С 1968 года – актёр в труппе Малого театра.
Когда Самойлов оказался вне театра, его востребовал кинематограф, который давно возбуждал творческий интерес артиста. В труппе ГосТИМа работали первоклассные актёры, заслужившие известность и признание в кино, и первым среди них был И.В. Ильинский – настоящая звезда советского экрана. С разрешения В.Э. Мейрехольда Евгений Самойлов в 1934 году начал сниматься в лирической комедии «Случайная встреча» у режиссёра И.А. Савченко. В первом экранном образе Гриши Рыбина (1936) стали очевидны удивительное обаяние и жизнерадостное мироощущение артиста. В фильме «Том Сойер» режиссёра Лазаря Френкеля он проявил талант характерного актёра, создав образы братьев-близнецов адвоката и доктора Робинзонов. В 1937 году на Киевской киностудии шли съёмки фильма «Щорс», но режиссёр А.П. Довженко упорно искал «своего» Щорса. Один из его ассистентов видел Евгения Самойлова в роли Корчагина на генеральной репетиции. Артиста пригласили на пробы, и всё, что было накоплено в роли Павки Корчагина, он показал на первой и единственной пробе. Режиссер нашёл артиста красивого и серьезного, в глазах которого он ощутил благородный ум и высокие чувства. Самойлов вновь обрёл учителя, наставника в кино, гениального режиссёра романтического направления, поэта и философа, великого по своим нравственным убеждениям человека – Александра Петровича Довженко.

Не принимая наигрыша и малейшей фальши, Довженко учил Самойлова в работе над ролью Щорса «идти от себя» в «предлагаемых обстоятельствах», чтобы лучше видеть и понять веления души своего героя. Только когда артист осознает чужой внутренний мир как собственную душу, он будет правдивым и искренним в перевоплощении, тогда ему поверят зрители. Это правило стало для артиста определяющим в творчестве, а в образе Щорса (1939) помогло донести до зрителей революционную романтику своего героя, страстную веру в прекрасное будущее, благородство души и силу интеллекта. Самойлов, подобно талантливому полководцу Щорсу, ворвался стремительно в кинематограф, завоевал зрительскую любовь и общественное признание. Его стали приглашать видные режиссёры. В 1940 году артист снялся у Г.Л. Рошаля в роли Кирилла Ждаркина («В поисках радости»), у Г.А. Александрова в роли инженера Лебедева («Светлый путь»).

В музыкально-поэтическом фильме «В шесть часов вечера после войны» (1944) Е.В. Самойлов исполнил роль лейтенанта Кудряшова, испытал подлинное творческое волнение в работе с легендарным режиссёром И.А. Пырьевым, замечательными актёрами М.А. Ладыниной, И.А. Любезновым. Съёмочная группа работала на высоком подъеме в радостном предчувствии грядущей победы. Роль Кудряшова, одна из любимых у артиста, счастливо совпадала с его актёрскими возможностями и человеческими идеалами, позволила вновь изведать полноту жизни в образе. Поэтически обобщенный образ героя войны, воина-защитника и победителя, одухотворенный обаянием личности артиста, был узнаваемым и желанным, как ожидаемая победа.

В начале 1945 года на экраны вышла комедия «Сердца четырёх» режиссера К.К. Юдина, снятая ещё до войны, в 1941 году. Герой Самойлова – лейтенант Колчин, мужественный, серьёзный и ослепительно красивый, воспринимался зрителями военного времени как победитель.

Светлые, гармоничные, жизнеутверждающие образы, созданные артистом в комедиях 1940-х годов, вселяли оптимизм и надежду, укрепляли веру в добро, любовь и дружбу. Зрители влюблялись в героев Самойлова, и так же горячо они любили и их создателя, вознеся своего кумира на киноолимп. К нему пришла слава.

Кинематограф открыл притягательную силу творческой индивидуальности Самойлова, присущее ему неотразимое обаяние положительного героя. Артиста всегда привлекали открытые, внутренне чистые характеры. Большинство его экранных героев принадлежало к воинскому сословию разных эпох, и артисту удалось передать их героическую самоотверженность и патриотизм, благородство, доблесть и верность офицерской чести.

Любимым героем Самойлова стал генерал Скобелев («Герои Шипки», режиссёр С.Д. Васильев, 1955). Изучение исторических документов, воспоминаний современников о Скобелеве помогло артисту осмыслить и полнее ощутить своеобразие его личности. Самойлов зажил в образе так же отважно и весело, как воевал храбрый генерал. За пышными усами военного мужа проглядывало порой лицо задиристого мальчишки. Памяти А.П. Довженко посвятил Самойлов образ полковника Александра Петровича («Зачарованная Десна», режиссёр Ю.И. Солнцева, 1964).
С 1984 года Е.В. Самойлов неоднократно избирался ректоратом Театрального училища имени М.С. Щепкина на пост председателя Государственной экзаменационной комиссии.

Личная жизнь Е.В. Самойлова сложилось на редкость счастливо. В юности он встретил свою единственную любимую женщину – Зинаиду Ильиничну Левину (1914 - 1994), и они прожили в любви и дружбе 62 года. Окончив электротехнический институт, супруга Самойлова оставила профессию инженера, посвятив себя заботам о муже и детях. Натура одаренная, она прекрасно играла на рояле, страстно любила искусство театра и, радуясь творческим успехам мужа, как никто другой, знала и понимала, каких физических и духовных затрат требовала актёрская профессия. Её душевными усилиями сберегалась атмосфера дома, в котором было радостно, хорошо, гостеприимно. Редкие свободные часы Самойлов всегда любил проводить в кругу семьи.

Их дети, воспитанные в почитании искусства, унаследовали профессию отца. Татьяна Самойлова – народная артистка России, известная киноактриса. Алексей Самойлов посвятил себя театру: работал в театре «Современник», с 1977 года – артист Малого театра. После смерти жены сын был самым близким другом и помощником в житейских делах.

После знакомства с С.Т. Коненковым Евгений Самойлов, заинтересованный его деревянной скульптурой, увлёкся резьбой по дереву, отдавая любимому занятию часы досуга. Постоянно перечитывал произведения А.П. Чехова – любимого писателя. Любимыми композиторами были П.И. Чайковский и М.П. Мусоргский.

Народный артист РСФСР (1953).
Народный артист СССР (04.11.1974).

Актёр скончался 17 февраля 2006 года на 94-м году жизни в Москве. Похоронен на Ваганьковском кладбище столицы, участок № 25.
ТЕАТРАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
Кривой Зуб, Актёр, Васька Пепел («На дне» А.М. Горького)
Председатель укома («Шторм» В.Н. Билль-Белоцерковского)
Эрнани («Эрнани» Виктора Гюго)
Чацкий («Горе от ума» А.С. Грибоедова)
Нелькин («Свадьба Кречинского» А.В. Сухово-Кобылина)
Григорий Отрепьев («Борис Годунов» А.С. Пушкина) (не завершена)
Павка Корчагин («Одна жизнь» по роману «Как закалялась сталь» Н.Островского)
Герман («Таня» А.Н. Арбузова)
Мортимер («Мария Стюарт» Ф.Шиллера)
Алексей «Сыновья трёх рек» В.Гусева)
Охлопков поставил Олега Кошевой «Молодая гвардия» А.А. Фадеева )
Ладыгин («Обыкновенный человек» Л.Леонова)
Рокоссовский («Великие дни» Н.Вирты)
Ковалев («Хлеб наш насущный» Н.Вирты)
Гончаров («Закон чести» А.Штейна)
Серго Орджоникидзе («Путь в грядущее» С.Марвича)
Антипа («Зыковы» А.М. Горького)
Гамлет («Гамлета» У.Шекспира)
Суходолов («Сонет Петрарки» Н.Погодина)
Антон («Дальняя дорога» А.Н. Арбузова)
Анохин («Время любить» Б.Ласкина)
Громов («Аристократы» Н.Погодина)
Платонов («Океан» А.Штейна)
Генерал Бондарев («Перебежчик» П.Тура)
Ясон («Медея» Еврипида, 1961)
Иван Петрович Шуйский («Царь Фёдор Иоаннович» А.К. Толстого)
Захарьин-Юрьев («Смерть Иоанна Грозного» А.К. Толстого)
Игнат Гордеев («Фома Гордеев» А.М. Горького)
Крутицкий («Не было ни гроша, да вдруг алтын» А.Н. Островского)
Карп, старый лакей («Лес» А.Н. Островского)
Мастаков («Старик» А.М. Горького»)
Ватутин («Обрыв» И.А. Гончарова)
Лопахин («Вишневый сад» А.П. Чехова)
Андреа Дориа («Заговор Фиеско в Генуе» Ф.Шиллера)
Камердинер герцога («Коварство и любовь» Ф.Шиллера)
Ученый Бармин («Человек и глобус» В.Лаврентьева)
Майор Васин («Русские люди» К.М. Симонова)
Лев Сушкин («Золотые костры» И.Штока)
Платон Ангел («Дикий Ангел» А.Коломийца)
Адольф («Незрелая малина» И.Губача, 1983) и др.
ПРИЗЫ И НАГРАДЫ
Сталинская премия первой степени (1941) за главную роль в фильме "Щорс"
Сталинская премия второй степени (1946) за роль Василия Кудряшова в фильме "В шесть часов вечера после войны"
Сталинская премия первой степени (1947) за роль Олега Кошевого в спектакле "Молодая гвардия" А.А. Фадеевва

Кавалер орденов Октябрьской Революции, Трудового Красного Знамени, «За заслуги перед Отечеством» III и IV степени.

Награжден медалями «За оборону Москвы», «За доблестный труд в Великой Отечественной войне 1941–1945 гг.», «В память 800-летия Москвы», «За освоение целины», «Ветеран труда», «В память 850-летия Москвы»; значком «Отличник культурного шефства над Вооруженными Силами СССР».